DPPH 自由基清除能力試劑盒說明書

(50 管/48 樣) 

此法是根據 DPPH 自由基有單電子，在 517nm 處有一強吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，呈現的顏色越淺，即 A 值越低，進而對樣本中 DPPH 清除能力進行定量分析。

二、試劑組成與配置：

試劑名稱	規格	保存	備注
試劑一	工作液粉劑×1 瓶	4℃避光	臨用前甩幾下使試劑落入底部，再加入 40mL無水乙醇充分溶解后備用；用不完的試劑 4℃避光保存
試劑二	標準品粉劑×1 支	4℃	制作標準曲線用

三、所需儀器和用品：
可見光分光光度計、1mL 比色皿（光徑 1cm）、離心機、移液器、無水甲醇、無水乙醇、蒸餾水。
四、實驗步驟：
操作前請仔細閱讀第六點《注意事項》,了解相關注意點。
1、樣本前處理：
① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，剪碎，加入 1mL 的 80%甲醇溶液（或按樣本重量 g：80%甲醇溶液體積 mL 為1:10 或 1:5 的比例加），冰水浴勻漿，12000 轉/分鐘，離心 10 分鐘，取上清置冰上待測。
② 液體樣本：直接檢測，若渾濁，離心后取上清測定。
2、操作步驟：（EP 管中操作）

	對照管	測定管	空白管
樣本（μL）	400	400
80%甲醇（μL）	600		400
工作液（μL）		600	600
混勻，室溫 25℃避光靜置 30min，4000 轉/分鐘離心 5 分鐘，波長 517nm，吸取 800μL 至比色皿中，無水乙醇調零，測定各管吸光度值。

（注：做預試時若 A 測定－A 對照接近或小于 0.05，則需對樣本進行稀釋后再檢測，稀釋倍數代入公式計算；若樣本較多，建議分批次測定；空白管只需做 1-2 個）
五、結果計算：
1、標準曲線制作：
（將標準品粉劑一支加無水甲醇 2mL 溶解，即為 0.5mg/mL（Trolox）標準應用液，再用無水甲醇分別稀釋成 5μg /mL、10μg/mL、15μg /mL、20μg /mL、25μg /mL 參照下表代入操作）

標準品濃度(μg /mL)	0	5	10	15	20	25
標準液（μL）	400	400	400	400	400	400
工作液（μL）	600	600	600	600	600	600
混勻，室溫 25℃避光靜置 30min，波長 517nm，1cm 光徑，無水乙醇調零，測定各管吸光度

2、DPPH 自由基清除率（%）=(1-(A 測定－A 對照)÷A 空白)×100%
3、定義：用從標準曲線算得的相當于抗氧化劑 Trolox 的量來表示樣本的 DPPH 自由基清除能力。
4、計算公式：

六、注意事項：
1、樣本測試前一定要進行預試，一方面了解本批樣品情況（或所需稀釋倍數），否則如果清除率太大（≥90），計算結果偏低；另一方面也可熟悉實驗流程，避免樣本與試劑的浪費；
2、標準曲線也可根據需要來調整標準濃度，上限不大于 25μg/mL；
3、因乙醇易揮發，所以不建議用酶標儀來讀數；
4、操作時應在一個通風條件良好的環境中進行，以免吸入過量甲醇中毒；
5、本試劑盒僅用于科研。