乙型肝炎病毒前基因組RNA探針法熒光定量RT-PCR試劑盒說明書
發表時間：2024-02-20乙型肝炎病毒前基因組RNA探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Hepatitis B Virus Pregenomic RNA (HBV pgRNA) Probe qRT-PCR Kit
產品及特點；
乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus ，HBV）是一種 RNA 病毒 ， 會引起乙 型病毒性肝炎 ， 是一種以肝臟病變為主的傳染病 。臨床上以食欲減退、惡心、上 腹部不適、肝區痛、 乏力為主要表現 。部分患者可有黃疸發熱和肝大伴有肝功能 損害有些患者可慢性化 ，甚至發展成肝硬化 ， 少數可發展為肝癌 ， 對人體生命健 康造成嚴重損害 。本產品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測乙型肝炎病毒前基因組 RNA 的試劑盒 ，它具有下列特點：
1. 即開即用 ， 用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物和探針經過優化 ，分析靈敏性高。
3. 提供陽性對照 ， 便于區分假陰性樣品。
4. 特異性高 ， 引物是根據乙型肝炎病毒前基因組 RNA 高度保守區設計 ， 不會跟其他病毒的 RNA 發生交叉反應。
5. 既可用于定性檢測 ， 又可用于定量檢測 。用于定量檢測時線性范圍至少為 5個數量級。
6. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
7. 本產品只能用于科研。
規格及成分；
運輸及保存；
成分
編號
五孔盒包裝
探針法 qRT-PCR 緩沖液
190504a
500 μL（白蓋）
探針法 qRT-PCR 酶混合液
190504b
100 μL （紅蓋）
熒光 PCR 專用模板稀釋液
180701
1 mL（綠蓋）
乙型肝炎病毒前基因組 RNA 探針法 qRT-PCR 引物-探針混合液
15-55900yp
150 μL（棕色管）
乙型肝炎病毒前基因組 RNA 探針法 qRT-PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)
55900pc
50 μL（黃蓋）
說明書
15-55900sc
1份
低溫運輸 ， -20℃保存 ，保存期限為 12 個月。
自備試劑;
樣品 RNA ，超純水。
使用方法;
一、稀釋標準曲線樣品 （以 10E2- 10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例） 。
由于標準品濃度非常高 ， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行 ， 千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分 。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原 ，本 產品不提供活體樣品做陽性對照 ，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管 ，分別為 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液 ，最好用帶芯槍頭 ，下同。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品 。放冰上待用。
4. 換槍頭 ， 在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭 ， 在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品 。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
7. 如果有 N 個樣品 ， 最好設置 N+2 個提取 ，多出的是 PC（樣品制備陽性對 照） 和 NC（樣品制備陰性對照） ?？梢匀￡栃詫φ盏?nbsp; 10000 倍稀釋液 10 μL 再加上一定量的水 ，使總體積與待提取樣品的規定體積一致 ， 以此作為PC 。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA ，本試劑盒跟市場上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容 。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout 或免提取核酸釋放劑。
三、 probeqRT-PCR反應(20L體系， 在祥品制備室進行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復 ， 則標記 N+9 個 RT-PCR 管 ，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 6 個用于標準曲線 。如果做定性分析并且只做 1 次重復 ，則標記 N+4 個 RT- PCR 管 ， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 RT-PCR 陰 性對照（用水做模板） ， 1 個用于 RT-PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板） 。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復 。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照 ， 并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好
后最后加）;
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成分/每管 |
樣品管N+2個 |
RT-PCR陰性對照 |
標準曲線樣品管(2-7管) |
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探針法 qRT-PCR 緩沖液 |
10 μL |
10 μL |
10 μL |
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探針法 qRT-PCR 酶混合液 |
2 μL |
2 μL |
2 μL |
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乙型肝炎病毒前基因組 RNA 探針法 qRT-PCR 引物-探針混合液 |
3 μL |
3 μL |
3 μL |
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N+2 個待測 RNA 樣本 |
5 μL |
不加 |
不加 |
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自備超純水 |
不加 |
5 μL |
不加 |
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第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號） |
不加 |
不加 |
5μL（ 2 號樣到 2 號管 ，3 號樣 到 3 號管 …） |
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過程 |
溫度 |
時間 |
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逆轉錄 |
50℃ |
20 min |
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預變性 |
94℃ |
5 min |
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RT-PCR 反應 （45 個循環） |
94℃ |
20 sec |
|
62℃ |
20 sec （采集 FAM 通道的熒光信號） |
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72℃ |
40 sec |
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測 ，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸 ， 以 Ct 值 為縱軸 ，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值 ， 再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測 ， 只判斷陽性或陰性 ，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40 。陽性對照必須有熒光對數增長 ， 有典型擴增曲線 ，Ct 值應該 小于或等于 38 。對待測樣品 ，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性 ，如果小 于或等于 38 則為陽性 。如果在 38-40 之間 ， 則重復一次 。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性 ， 如果小于 40 ，則為陽性。
