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ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性,又保留酶的活性。在測 定時,受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應 而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化成為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據呈色的深淺進行 定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應的結果,使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體。
然而,影響Elisa試驗結果的因素很多,故加強各個環節的質量保證才能充分發揮其方法學的優點。
操作步驟:
1. 準備試劑:ELISA 試劑盒中包含以下組分:已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑)、酶標記的抗原或抗體(結合物)、酶的底物、陰性對照品和陽性對照品(定性測定中)、參考標準品和控制血清(定量測定中)、結合物及標本的稀釋液、洗滌液和酶反應終止液。
2. 包被:用包被緩沖液將抗原或抗體稀釋至適當濃度,然后在每個聚苯板的反應孔中加入 0.1ml,4℃過夜。
3. 洗滌:棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液清洗反應孔,重復 3 次,每次 3 分鐘。
4. 加樣:將待檢樣品和陰性對照品、陽性對照品按一定稀釋度加入已包被的反應孔中,37℃孵育 1 小時。
5. 洗滌:再次清洗反應孔。
6. 加酶標記物:將酶標記的抗原或抗體加入反應孔中,37℃孵育 1 小時。
7. 洗滌:清洗反應孔。
8. 加底物:每個反應孔中加入適量的酶底物,37℃孵育 10-30 分鐘。
9. 終止反應:加入終止液,終止酶促反應。
10. 讀數:用酶標儀檢測各反應孔的吸光度值,根據標準曲線計算待測樣品的濃度。
通過上述步驟,可以實現對特定抗原或抗體的高靈敏度檢測。
（SCC)ELISA試劑盒操作注意事項:
1)試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
2)實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
3)不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4)使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5)使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6)洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7)底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8)加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9)按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
大鼠（SCC)ELISA試劑盒性能
1. 靈敏度:的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特:不與其它細胞因子反應。
3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%。
常見祥本處理方法
1、血清:用無菌管收集,室溫血液自然凝固1020分鐘,2 -8C條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。
2、血漿:應根據標本的要求選擇EDTA、或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10 20分鐘后,2-8C條件離心20分鐘左右(2000 3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。
3、細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。2 8C條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分),仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
4、組織標本:切割標本后,稱取1g組織,加入9g的pH7. 2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000 3000轉/分),仔細收集上清。分裝一份待檢測,其余冷凍備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。對于植物組織,不好勻漿的話,就在液氮中充分研磨:
5、其他樣本處理方法:請聯系客服索要
溫馨提醒
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